一、 细胞基本信息与特性
细胞名称:CEM/C1(CCRF-CEM 的耐药亚株,ATCC CRL-2265)
细胞来源:人(Homo sapiens,4岁女性外周血)
形态特征:淋巴母细胞样,呈圆形或近圆形。
生长特性:悬浮生长(Suspension)
疾病类型:T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)
二、 实验前准备
1. 主要试剂
基础培养基:1640基础培养基(含谷氨酰胺)(Evacell,E2103)
血清:10% 胎牛血清(FBS)(Evacell,E01011)
双抗(可选):1% 青霉素-链霉素混合液(P/S, 100 U/mL)(Evacell,E3102)
消化液:0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)(Evacell,E31030)
缓冲液:灭菌 PBS(pH 7.4)(Evacell,E2119)
冻存液:完全培养基 + 10% DMSO(或 55% DMEM + 40% FBS + 5% DMSO)或无血清冻存液(Evacell,E4111)
2. 完全培养基配制
1640基础培养基(含谷氨酰胺)(Evacell,E2103)
胎牛血清(FBS):10%(Evacell,E01011)
青链霉素(P/S):1%(Evacell,E3102)
注:配制后于 4℃ 保存,建议 2–4 周内用完;使用前需提前在 37℃ 水浴或室温预热。
3. 培养条件
温度:37 ℃
气体:5% CO,95% 空气
湿度:饱和湿度
三、 全套操作流程
1. 细胞复苏(Cell Thawing)
核心原则:快速融化,尽早除去 DMSO 的细胞毒性。
准备:提前将水浴锅加热至 37℃,准备好含 5-8 mL 预热完全培养基的 15 mL 离心管,以及培养瓶/皿。
取细胞:从液氮或 -80℃ 冰箱快速取出冻存管,立即放入 37℃ 水浴锅中摇晃,使其在 1–2 分钟内融化。
洗涤/去毒:
将融化的细胞悬液转移至准备好的离心管中,补加完全培养基。
1000 rpm (约 200×g) 离心 3–5 分钟。
弃去上清液,加入 2–3 mL 预热完全培养基,用枪头轻柔吹打重悬细胞。
接种:将细胞悬液转移至培养皿/瓶中,补足培养基,轻轻摇匀(画“8”字),置于 37℃、5% CO 培养箱中培养。
观察:复苏 12–24 小时后观察细胞贴壁情况,必要时更换新鲜培养基。
2. 细胞日常维护与传代(Cell Passage)
传代时机:细胞密度达到 80%–90% 时进行传代。切勿让细胞过满(100%),否则易抱团脱落并影响后续实验。
弃液与清洗:
弃去旧培养基。
沿着培养皿壁缓慢注入 2–3 mL 预热的 PBS(Evacell,E2119),轻轻摇晃后弃去。(注意:动作必须极其轻柔,293T 贴壁力差,冲力过大会冲落细胞)。
消化:
加入 1 mL(以 10cm 皿为例)0.25% 胰酶-EDTA(Evacell,E31030),铺满皿底。
室温或 37℃ 消化 30–60 秒。显微镜下观察,当细胞变圆、轻拍皿壁细胞即可成片脱落时,立即终止消化。(293T 极易消化,时间切勿过长)。
终止与离心:
加入 2–3 倍体积的完全培养基(含血清)终止消化。
轻轻吹打皿底,使细胞完全脱落并打散成单细胞悬液。
转移至 15 mL 离心管,1000 rpm 离心 3 分钟,弃上清。
重悬与分瓶:
加入新鲜完全培养基重悬细胞,反复轻柔吹打 10–15 次,尽量打散细胞团块。
按 1:3 至 1:8 的比例接种到新的培养皿中,补足培养基,摇匀后送回培养箱。
3. 细胞冻存(Cell Freezing)
冻存时机:选择处于对数生长期的健康细胞(密度约 80%)。
消化与离心:按传代步骤消化细胞,离心后弃上清,收集细胞沉淀。
重悬:加入提前配制好的冻存液(推荐密度:
1×1065×106(cells/mL),轻轻吹打均匀。
分装:分装至灭菌冻存管中,每管 1–1.5 mL,写明细胞名称、代数、冻存日期及操作人。
梯度降温:
将冻存管放入程序降温盒(含异丙醇或梯度降温盒),置于 -80 ℃ 冰箱过夜。
24 小时后,快速转移至 液氮罐 中长期保存。
四、 关键注意事项(新手避坑指南)
1. 切忌像贴壁细胞一样盲目弃液
悬浮细胞不附着于瓶壁,操作时千万不能直接倒掉上清;换液或传代前必须混匀取样或通过离心收集。
不需要使用胰酶(Trypsin)消化。
2. 严格控制起始接种密度(密度依赖性)
CEM/C1 对密度较为敏感。接种密度过低(<1×105cells/mL)会导致细胞停止增殖或大面积死亡;密度过高(>1.5×106 cells/mL)则会导致培养液快速酸化(变黄)、营养耗尽并引起自发凋亡。
3. 轻柔操作,避免强力吹打
白血病悬浮细胞膜相对脆弱,离心转速建议控制在 800–1000 rpm(≤250×g)。剧烈吹打或过高转速会产生大量细胞碎片并引发细胞裂解。
4. 轻微聚团为正常现象
显微镜下该细胞常呈现单颗分散或 3-10 个细胞松散聚集的小簇(Clustering),属于正常状态;若出现大量黑色沉淀样的大团块且培养基发黄,提示细胞状态不佳或存在死细胞释放的 DNA 黏连,此时建议过 40m 筛网或低速离心重悬优化。
5. 耐药特性的维持与验证
CEM/C1 属于耐药细胞系。若后续实验涉及喜树碱(CPT)耐药机制研究,建议定期使用 CCK-8/MTT 检测其对药物的 IC50,以防长时间连续传代(通常超过 20–30 代)后耐药表型退化。
6. 培养容器放置技巧
在使用 T25/T75 培养瓶时,建议竖放(直立培养),以减少液体铺展面积增加底部局部的细胞密度与旁分泌相互作用,有利于细胞快速适应和生长。